Fra 1616-1777 fungerte bygningen som senere skulle bli kjent som National Archaeological Museum, først som sete for universitetet i Napoli og også som kavalerikaserne. på 1700-tallet etablerte Karl III av Bourbon museet, opprinnelig kjent som Det kongelige Bourbon-museet, drevet av hans interesse for kunst og kultur. Han hadde som mål å huse antikviteter arvet fra sin mor, Elisabetta Farnese, og skattene fra de nylig oppdagede byene Herculaneum og Pompeii, som begge ble ødelagt av Vesuvs utbrudd.
Senere beriket Ferdinand VI, Karl IIIs sønn, museets samling ytterligere ved å kuratere Elisabetta Farneses romerske kunstprodukter og vesuvianske funn i museet. Under det franske herredømmet i Napoli ble de første fasilitetene for museet organisert.