Fra 1616-1777 fungerede den bygning, der senere skulle blive kendt som det nationale arkæologiske museum, oprindeligt som sæde for universitetet i Napoli og også som kaserne for kavaleriet. I det 18. århundrede etablerede Karl III af Bourbon museet, der oprindeligt var kendt som det kongelige Bourbon-museum, drevet af hans interesse for kunst og kultur. Han ville huse antikviteter, som han havde arvet fra sin mor, Elisabetta Farnese, og skatte fra de nyligt opdagede byer Herculaneum og Pompeji, som begge blev ødelagt af Vesuvs udbrud.
Senere berigede Ferdinand VI, Karl III's søn, museets samling yderligere ved at kuratere Elisabetta Farneses romerske artefakter og vesuvianske fund i museet. Under det franske herredømme i Napoli blev de første faciliteter til museet organiseret.
